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化膿及創(chuàng)傷感染標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)知識(shí)
膿液及創(chuàng)傷分泌物是傳染過(guò)程中最常見(jiàn)的，對(duì)其標(biāo)本的采集和送檢，檢驗(yàn)人員與執(zhí)業(yè)醫(yī)師網(wǎng)臨床醫(yī)師應(yīng)密切配合，以確保正確的采集和快速送檢。從膿液及創(chuàng)傷分泌物中能夠檢出的細(xì)菌種類(lèi)很多，最優(yōu)先考慮的致病菌為金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌，其次為假單胞菌、腸桿菌科細(xì)菌等。下面是小編為大家?guī)?lái)的化膿及創(chuàng)傷感染標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)知識(shí)，歡迎閱讀。
知識(shí)1：
一、膿液及創(chuàng)傷感染標(biāo)本中可能發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌
在臨床化膿及創(chuàng)傷感染標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中可能發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌：
1.革蘭陽(yáng)性球菌
葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、四聯(lián)球菌。
2.革蘭陰性球菌
卡他布蘭漢菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、干燥球菌、黃色球菌。
3.革蘭陽(yáng)性桿菌
破傷風(fēng)芽胞梭菌、炭疽芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜芽胞梭菌、白喉棒狀桿菌、類(lèi)白喉棒狀桿菌、結(jié)核分枝桿菌。
4.革蘭陰性桿菌
大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉熱弗朗西斯菌、肺炎克雷伯菌、厭氧桿菌。
5.其他
伊色列放線(xiàn)菌、星形奴卡菌、白色假絲酵母菌。
二、標(biāo)本的采集
(一)操作
1.首先用無(wú)菌生理鹽水拭凈病灶表面的污染雜菌。
2.對(duì)已破潰膿腫一般以無(wú)菌棉拭子采取膿液及病灶深部的分泌物，而瘺管則以無(wú)菌方法采取組織碎片，放入無(wú)菌試管中送檢。
3.對(duì)未破潰膿腫最好用2.5%～3%碘酊和75%酒精消毒患部皮膚后，以無(wú)菌注射器抽取膿汁及分泌物，也可于切開(kāi)排膿時(shí)，以無(wú)菌棉拭采取。
4.有時(shí)也可將沾有膿汁的最內(nèi)層敷料放入無(wú)菌平皿內(nèi)送檢。
5.對(duì)放線(xiàn)菌的標(biāo)本，常用無(wú)菌棉拭擠壓瘺管，選取流出膿汁中的“硫磺樣顆粒”盛于試管內(nèi)送檢，也可將滅菌紗布塞入瘺管內(nèi)。次日取出送檢。
(二)注意事項(xiàng)
1.如果患者局部傷口已用抗生素磺胺類(lèi)藥物治療，則應(yīng)在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)的物質(zhì)(如青霉素酶、對(duì)氨基苯甲酸等)以避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。
2.當(dāng)創(chuàng)傷出血時(shí)或敷有藥物在2小時(shí)以?xún)?nèi)及燒傷在12小時(shí)內(nèi)均不應(yīng)采集標(biāo)本，此時(shí)獲得陽(yáng)性結(jié)果的機(jī)會(huì)甚少。
3.標(biāo)本采取后應(yīng)及時(shí)檢查，如不能立即檢驗(yàn)應(yīng)置冰箱內(nèi)保存，以防雜菌污染。
4.采集標(biāo)本時(shí)注意觀察膿汁及分泌物的性狀，色澤及有無(wú)惡臭味等，為培養(yǎng)和鑒定提供參考依據(jù)。如膿汁帶綠色時(shí)，可能有銅綠假單胞菌的感染，有惡臭味時(shí)可能有厭氧菌感染。
三、檢驗(yàn)程序
膿液及創(chuàng)傷感染標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)程序參見(jiàn)圖
化膿及創(chuàng)傷感染標(biāo)本的檢驗(yàn)程序
四、檢驗(yàn)方法及報(bào)告方式
(一)直接涂片檢查
1.一般細(xì)菌涂片檢查
取一潔凈玻片，用玻璃筆標(biāo)明標(biāo)本號(hào)、將待檢標(biāo)本置于玻片上涂成薄膜，經(jīng)火焰固定后進(jìn)行革蘭染色鏡檢。根據(jù)鏡下所見(jiàn)細(xì)菌的形態(tài)及染色特點(diǎn)，可做初步報(bào)告：“找到革蘭X性X菌，形似XX菌”。如發(fā)現(xiàn)具有芽胞或莢膜的細(xì)菌，報(bào)告時(shí)應(yīng)注明其大小與位置及疑似XX菌。如鏡檢時(shí)未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌時(shí)，可初步報(bào)告為：“直接涂片，未找到細(xì)菌”。對(duì)疑有結(jié)核分枝桿菌感染的標(biāo)本，還應(yīng)作抗酸染色檢查。
2.伊色列放線(xiàn)菌及星形奴卡菌涂片檢查
用肉眼或放大鏡檢查膿汁、分泌物或敷料內(nèi)有無(wú)直徑1mm以下的灰白色或硫磺樣顆粒，用接種環(huán)挑取含有硫磺樣顆粒的標(biāo)本置于潔凈的玻片內(nèi)，覆以蓋玻片，輕輕擠壓。若顆粒結(jié)構(gòu)不明顯，可加50g～100g/L的氫氧化鉀溶液2～3滴加以消化。用低倍鏡及高倍鏡仔細(xì)觀察。如有伊色列放線(xiàn)菌的顆粒，可見(jiàn)中央為交織的菌絲，菌絲的末端稍膨大似棒狀排列并呈放射狀。有時(shí)可見(jiàn)嵌于類(lèi)似明膠的鞘膜內(nèi)。奴卡菌與伊色列放線(xiàn)菌形態(tài)基本上相同，但在分枝菌絲末端一般不膨大成棒狀，革蘭染色陽(yáng)性，抗酸染色呈抗酸性;而伊色列放線(xiàn)菌革蘭染色陽(yáng)性，抗酸染色呈藍(lán)色，為非抗酸性。如查見(jiàn)中間部分菌絲染成革蘭陽(yáng)性，向四周放射的末梢部分菌絲呈革蘭陰性，抗酸染色為非抗酸性者，可報(bào)告：“找到伊色列放線(xiàn)菌”;若革蘭染色反應(yīng)與伊色列放線(xiàn)菌相同，而抗酸染色為抗酸性者，可報(bào)告為：“找到奴卡菌。”
如革蘭染色為陰性，抗酸染色為非抗酸性者，可報(bào)告：“未找到伊色列放線(xiàn)菌及星形奴卡菌”。
(二)培養(yǎng)檢查
1.一般細(xì)菌培養(yǎng)
取膿汁棉拭子或?qū)⒛撝媒臃N環(huán)接種于血平板上劃線(xiàn)分離，置37℃孵箱培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果，如有細(xì)菌生長(zhǎng)，可按菌落特征挑取各種單獨(dú)的菌落，分別涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢。通常根據(jù)菌落特點(diǎn)結(jié)合涂片結(jié)果，多可初步判斷出細(xì)菌的類(lèi)屬，然后再按各類(lèi)細(xì)菌的生物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定。菌落小如針尖，周?chē)橛写蠖该鞯娜苎h(huán)可能為溶血性鏈球菌，結(jié)合鏡檢有助于鑒別，必要時(shí)進(jìn)行血清肉湯培養(yǎng)，若出現(xiàn)沉淀生長(zhǎng)且涂片染色為長(zhǎng)鏈狀排列，即可報(bào)告：“培養(yǎng)出乙型溶血性鏈球菌。”血平板上見(jiàn)中等大小有脂溶性金黃色色素或無(wú)特殊色素有透明溶血環(huán)，涂片染色為革蘭陽(yáng)性球菌呈葡萄狀排列，可進(jìn)一步作甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)，血漿凝固酶試驗(yàn)等，如陽(yáng)性時(shí)，可報(bào)告：“培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌”。如見(jiàn)到菌落與醫(yī).學(xué)全在線(xiàn)上述近似但無(wú)溶血環(huán)，血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，可初步報(bào)告：“培養(yǎng)出血漿凝固酶陰性葡萄球菌”。如見(jiàn)菌落小，周?chē)胁菥G色溶血環(huán)，染色鏡檢為革蘭陽(yáng)性球菌，呈短鏈排列多為甲型溶血性鏈球菌，呈雙排列多為肺炎鏈球菌。確定診斷則需進(jìn)一步作鑒定試驗(yàn)和鑒別試驗(yàn)。如有變形桿菌生長(zhǎng)而影響其他細(xì)菌分離，可將標(biāo)本接種于含有4g/L硼酸的血平板上，以抑制變形桿菌生長(zhǎng)，再進(jìn)行分離培養(yǎng)、鑒定。根據(jù)鑒定結(jié)果及菌落的多少，即可報(bào)告：“培養(yǎng)出XX菌”。如觀察48小時(shí)后，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，可報(bào)告：“培養(yǎng)48小時(shí)后，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)”。若遇到難以鑒定的細(xì)菌時(shí)，應(yīng)詳細(xì)描述革蘭染色性質(zhì)、菌體以及菌落的形態(tài)特點(diǎn)、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果等，必要時(shí)做G+C摩爾百分比濃度測(cè)定、動(dòng)物試驗(yàn)觀察其致病力，以供臨床醫(yī)師參考。
2.炭疽芽胞桿菌培養(yǎng)
疑為炭疽芽胞桿菌感染時(shí)，可取患部膿液接種于血平板，對(duì)于污染嚴(yán)重的標(biāo)本，可首先在肉湯培養(yǎng)基內(nèi)增菌一夜后，經(jīng)80℃20分鐘加熱，殺滅非芽胞細(xì)菌，然后再移種血平板作分離培養(yǎng)，經(jīng)37℃18～24h培養(yǎng)后，如在血平板上見(jiàn)有大而扁平、毛茸狀、灰白色、邊緣不整齊，形似卷發(fā)狀(以低倍鏡下觀察更為清楚)不溶血的菌落，則挑取菌落涂片染色鏡檢，如為革蘭陽(yáng)性竹節(jié)狀大桿菌，排列呈鏈狀，懸滴檢查無(wú)動(dòng)力，則可作出初步診斷，必要時(shí)再做動(dòng)物接種以及串珠試驗(yàn)和噬菌體裂解等鑒別試驗(yàn)，并作出結(jié)論。
3.厭氧菌培養(yǎng)
疑為厭氧菌感染的標(biāo)本，可將標(biāo)本接種于牛心、牛腦浸出液或布氏菌肉湯培養(yǎng)基中，亦可直接接種KVA血平板(或LKV血平板)，置厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。分離厭氧芽胞桿菌如破傷風(fēng)芽胞梭菌及產(chǎn)氣莢膜芽胞梭菌時(shí)，應(yīng)將已接種標(biāo)本的液體培養(yǎng)基先置80℃水浴中加熱20分鐘殺滅非芽胞細(xì)菌，然后經(jīng)37℃24～48h培養(yǎng)后，根據(jù)生長(zhǎng)情況及涂片染色鏡檢結(jié)果，按該厭氧菌的生物學(xué)性狀(生化反應(yīng)和動(dòng)物試驗(yàn))進(jìn)行鑒定。經(jīng)最后證實(shí)，即可報(bào)告：“培養(yǎng)出XX菌”。若經(jīng)3～5天培養(yǎng)仍未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)者，即可報(bào)告：“厭氧培養(yǎng)X天未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)”。
4.伊色列放線(xiàn)菌及星形奴卡菌培養(yǎng)
(1)若疑有雜菌污染的瘺管引流液，應(yīng)首先將標(biāo)本倒入無(wú)菌平皿內(nèi)，以無(wú)菌蒸餾水洗滌溶解血細(xì)胞后，再挑選典型或可疑的硫磺樣顆粒，將其壓碎，然后分別接種于兩份葡萄糖肉湯瓊脂平板上置37℃進(jìn)行需氧及厭氧培養(yǎng)，同時(shí)接種沙保弱葡萄糖瓊臘斜面(或平板)上，置22℃～28℃培養(yǎng)。如無(wú)硫磺樣顆粒，也可取標(biāo)本直接接種于上述培養(yǎng)基。
(2)對(duì)于未被細(xì)菌或真菌污染的標(biāo)本，可直接采取硫磺樣顆粒或膿液接種人硫乙醇酸鈉肉湯或深層葡萄糖肉湯瓊脂培養(yǎng)基，置37℃進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，同時(shí)接種沙保弱葡萄糖瓊脂斜面，置22℃～28℃培養(yǎng)。
(3)經(jīng)4天培養(yǎng)后，若在厭氧培養(yǎng)的葡萄糖肉湯瓊脂平板上見(jiàn)有白色、粗糙或結(jié)節(jié)狀的菌落生長(zhǎng)，粘附于培養(yǎng)基上不易用接種環(huán)取下，且在鹽水內(nèi)不易乳化，而在需氧培養(yǎng)的平板上則無(wú)類(lèi)似菌落生長(zhǎng)時(shí)，可疑為伊色列放線(xiàn)菌。
(4)將疑為伊色列放線(xiàn)菌的菌落移種于硫乙醇酸鈉肉湯管的底部：置37℃培養(yǎng)4～6天后，可見(jiàn)有白色絨毛樣菌團(tuán)物長(zhǎng)出，搖動(dòng)后破碎，上部培養(yǎng)液仍保持澄清。移種于葡萄糖肉湯瓊脂作深層培養(yǎng)，經(jīng)37℃培養(yǎng)4～6天后，可見(jiàn)在深層培養(yǎng)管表面下層出現(xiàn)分葉狀的菌落。取菌落作涂片鏡檢，可見(jiàn)有交織成團(tuán)或小碎片狀菌絲，抗酸染色為非抗酸性菌絲，可報(bào)告：“有伊色列放線(xiàn)菌生長(zhǎng)”。
(5)如有奴卡菌生長(zhǎng)，則在需氧培養(yǎng)的沙保弱培養(yǎng)基上出現(xiàn)光滑、不規(guī)則折疊或顆粒狀的菌落，具有黃色至橙黃色的顏色，取菌落作濕片鏡檢，如發(fā)現(xiàn)精細(xì)分枝狀菌絲，呈革蘭陽(yáng)性，抗酸性染色呈紅色的菌絲者，可報(bào)告：“有奴卡菌生長(zhǎng)”。
(三)抗生素敏感試驗(yàn)提示
1.接到標(biāo)本后，48小時(shí)內(nèi)應(yīng)得出抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果。
2.由于鏈球菌、巴斯德菌和放線(xiàn)菌等幾乎都對(duì)青霉素敏感，故不必對(duì)其測(cè)試抗生素敏感性。
3.耐苯唑西林的葡萄球菌對(duì)頭孢菌素亦耐藥，耐青霉素的葡萄球菌對(duì)氨芐西林亦耐藥，不必重復(fù)測(cè)試。
知識(shí)2：
一、膿液是什么？
膿液（pus）是機(jī)體局部炎癥組織壞死的溶解產(chǎn)物。在炎癥過(guò)程中,由于局部血液循環(huán)嚴(yán)重障礙及病原菌的內(nèi)、外毒素作用等,可發(fā)生局部組織營(yíng)養(yǎng)不良及變性,最后導(dǎo)致壞死。壞死組織在細(xì)菌毒素及死亡的白細(xì)胞釋放出的蛋白酶作用下,水解化為肉眼呈灰黃色或黃白色的濃稠狀液體。一個(gè)白細(xì)胞處理5～25個(gè)病菌后就會(huì)死亡，死亡的白細(xì)胞體和細(xì)菌分解產(chǎn)物構(gòu)成膿液。因此膿液中主要由組織分解產(chǎn)物、炎癥滲出物、白細(xì)胞及死亡的細(xì)菌等組成。
二、微生物生長(zhǎng)需要的條件？人工培養(yǎng)細(xì)菌需要提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如：水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等，使細(xì)菌獲得生長(zhǎng)繁殖所需要的原料和能量。除此之外尚要有適宜的環(huán)境條件，如酸堿度、滲透壓、溫度和必要的氣體等，多數(shù)細(xì)菌在代謝過(guò)程中需要CO2，但分解糖類(lèi)時(shí)產(chǎn)生的CO2已足夠其所需，且空氣中還有微量CO2，不必額外補(bǔ)充，只有少數(shù)菌如布魯菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等必須在5%-10%CO2環(huán)境中才能生長(zhǎng)。
三、如何采集膿液和創(chuàng)傷分泌物標(biāo)本才能滿(mǎn)足細(xì)菌培養(yǎng)要求呢？檢驗(yàn)項(xiàng)目：膿汁和創(chuàng)面分泌物的一般細(xì)菌涂片、真菌涂片、結(jié)核菌涂片、細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定。標(biāo)本采集方法：
1、局部組織或器官有化膿性感染表現(xiàn)任何標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室建議在抗菌藥物使用前進(jìn)行采樣；采樣前可用無(wú)菌生理鹽水清洗病灶表面的污染雜菌，采集后立即送檢。
2、對(duì)已破潰開(kāi)放性膿腫用無(wú)菌生理鹽水或75%酒精擦去表面滲出物，用無(wú)菌拭子深入潰瘍基底部或邊緣部取，注意盡量取化膿組織與正常組織交界處的膿汁，因?yàn)槟撝行牡募?xì)菌大部分已死亡，交界處的活菌較多，會(huì)提高陽(yáng)性率。需取兩個(gè)拭子置無(wú)菌管中送檢，分別做細(xì)菌涂片和培養(yǎng)檢查。
3、封閉性膿腫：一般采用穿刺或手術(shù)引流的方法采取。采集前用75%酒精消毒膿腫局部皮膚或黏膜表面后，用無(wú)菌注射器穿刺抽取膿液5-10ml，置無(wú)菌管中送檢；也可切開(kāi)排膿用無(wú)菌棉拭子采取深部的分泌物送檢。
4、對(duì)瘺管的標(biāo)本，常用無(wú)菌棉拭子擠壓，選取膿汁中“硫磺樣顆粒”，置于無(wú)菌管中送檢。
5、如有惡臭等懷疑厭氧菌感染時(shí)，標(biāo)本采集后應(yīng)在30分鐘內(nèi)送檢。硫磺樣顆粒：在患者病灶組織和瘺管中流出的膿汁中，肉眼可見(jiàn)的由放線(xiàn)菌在組織中形成的黃色小顆粒狀菌落。
6、燒傷傷口：先清創(chuàng)，出現(xiàn)滲出物后用拭子用力采集病灶基底部或邊緣的標(biāo)本。也可送組織標(biāo)本。
7、膿皰或水皰：用酒精進(jìn)行表面消毒，待消毒液干燥，用針頭（小兒用23號(hào)針頭）挑破膿皰，用拭子采集膿皰液和基底部標(biāo)本。
三、注意事項(xiàng)：
①采樣前病灶局部應(yīng)避免用抗菌藥物或消毒劑，應(yīng)在用藥之前采取。
②對(duì)大多數(shù)開(kāi)放傷口，采集前應(yīng)先清創(chuàng)，去除表面菌群。
③除非有滲出物，干燥、結(jié)痂傷口取材一般不做培養(yǎng)。
④閉合膿腫應(yīng)取滲出物和膿腫壁標(biāo)本，不能用拭子采集。開(kāi)放膿腫處理同開(kāi)放傷口。
⑤不要僅僅送檢膿液，應(yīng)在病灶活動(dòng)區(qū)域或基底部采集標(biāo)本，最好是組織標(biāo)本。
四、標(biāo)本送檢與保存
1、送檢地點(diǎn)：南大港醫(yī)院二樓檢驗(yàn)科。
2、標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢，如果在1h內(nèi)不能及時(shí)送檢可保存在4℃冰箱中，但保存時(shí)間不超過(guò)24h。
3、懷疑淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌和厭氧菌感染需常溫立即送檢；禁止冷藏。
如果沒(méi)能及時(shí)送檢，放常溫超過(guò)1小時(shí)，細(xì)菌快速生老病死失去了診斷價(jià)值；放到4℃冰箱，淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌又會(huì)被凍死；因此一個(gè)合格的微生物檢驗(yàn)標(biāo)本對(duì)檢驗(yàn)前的各個(gè)環(huán)節(jié)，無(wú)論是采集指證、嚴(yán)格的無(wú)菌采集、標(biāo)本送檢及保存等過(guò)程實(shí)施有效的檢驗(yàn)前質(zhì)量控制是提高病原微生物檢出率，保障醫(yī)療質(zhì)量，有效指導(dǎo)臨床用藥的基本前提和先決條件。
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