真菌培養及鑒定方法有哪些

　　真菌的營養要求不向。在一般細菌培養基上均能生長。真菌培養及鑒定有哪些的呢?本文是小編整理真菌培養及鑒定的資料，僅供參考。

　　真菌培養及鑒定

　　1.采集標本 體表真菌的標本有毛發、皮屑、甲屑、痂等，標本在分離前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的標本可根據情況取痰、尿液、糞便、膿液、口腔或陰-道分泌物、血液、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織，采集標本應注意無菌操作。

　　2.培養檢查：可提高真菌檢出率，并能確定菌種。標本接種于葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基(Sabouraud agar)上，置室溫或37℃培養1～3周。必要時可行小培養協助鑒定。菌種鑒定常根據菌落的形態及顯微鏡下形態判斷。對某些真菌，有時尚需配合其他鑒別培養基、生化反應、分子生物學方法確定。

　　真菌培養的方法與直接鏡檢法相比較而言，更能對大部分真菌感染的灰指甲作出準確的鑒定，也是診斷灰指甲的一個很重要的手段。下面我們就從培養基的選擇、培養時間、菌種鑒定三方面來了解一下灰指甲的真菌培養法。

　　1.培養基的選擇

　　通常培養真菌會同時選用兩種培養基，如果單用一種培養基，則容易忽略其它種類的真菌診斷。常見的兩種培養基，一種為沙氏葡萄糖瓊脂培養基中加抗菌劑，常為氯霉素和放線菌酮;另一種是沙氏葡萄糖瓊脂培養基中僅加氯霉素，不加放線菌酮。

　　2.培養時間

　　各種真菌的生長速度不同，所以報告的時間也不同。一般皮膚癬菌生長較緩慢，在26℃-28℃的環境下需要培養2-4周才能發報告，但是，皮膚癬菌含蓋的菌種較多也需要區別對待;酵母菌生長較快，通常2-3就可以發報告，如果為陰性則需要觀察1周;霉菌生長也比較快，一般2-4天就可以發報告。

　　3.菌種鑒定

　　(1)絲狀真菌：包括皮膚癬菌和霉菌，根據菌落形成所需要的時間，在不同條件下生長的情況，菌落表面及背面的形態、色素，培養基中有無色素，培養物用乳酚棉藍染色后鏡檢找特征性標志結構。(2)酵母菌：分為形態學鑒定及生化試驗。形態學鑒定主要觀察有無假菌絲產生，如有則為念珠菌屬，如無則為念珠菌以外的酵母菌;生化試驗最為常用的是API系統，用此法鑒定準確，但價格較貴。

　　)絲狀真菌：主要是形態學的鑒定，如直接涂片觀察，小培養顯微鏡鑒定，誘導形態觀察(25℃與35℃下雙相型真菌的特征孢子及菌絲的產生和兩種菌落的形成及腦心浸液瓊脂培養基，KT培養基，KelleyAgar培養基轉相誘導，另外常用的還有皮膚癬菌VB1生長刺激，吳氏熒光檢查，毛發穿孔試驗及在特殊情況下進行的一些生化鑒定等。其中，小培養顯微鏡檢對于絲狀真菌的鑒定，特點是動態直觀，易于觀察，且節約材料。解放軍總醫院第一附屬醫院皮膚科馬天

　　(2)酵母菌鑒定：形態學鑒定主要是玉米吐溫誘導下特征菌絲及特征孢子的檢驗，血清芽管形成，而在形態學基礎上還必須進行生化鑒定：有標準鑒定，自動儀器鑒定，顯色鑒定，其中，自動儀器鑒定(如API20C，ID32C等)，顯色鑒定對于酵母樣真菌的鑒定，特點是快速簡便;標準鑒定是按傳統雙歧表流程鑒定(包括糖同化試驗，糖發酵試驗，CAFC酚氧化酶試驗，尿酶試驗，KNO3同化試驗，脂肪酸需求試驗)，是真菌鑒定的金標準，系統準確，缺點是程序繁瑣，耗時長，與臨床治療不太適應。此外，還有血清學玻片凝集試驗，動物致病性實驗，分子生物學鑒定：如核酸雜交，DNA探針雜交，PCR擴增序列分析，PCR-SSCP單鏈構象多態性分析，PCR-RFLP限制性片段長度多態性分析，PCR-RAPD隨機擴增多態性分析，PFCG脈沖電泳核型分析等。

　　對于酵母樣真菌首選CHROMagar念珠菌顯色培養基，而顯色培養基不能鑒定的酵母樣真菌可采用自動儀器YBC卡進行鑒定或API板;條件較差的實驗室可采用傳統標準鑒定法中鑒定值較高的試驗，如酚氧化酶鑒定新型隱球菌(+)，尿素區分毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(-)，念珠菌屬(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(+)，玉米-土溫培養基上產菌絲區分念珠菌屬(+)與球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(-)與毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(+)。而同化試驗推薦平皿法，一個平皿內可觀察多種糖類的同化情況，且結果易于觀察，重復性好。對于絲狀真菌及雙相型真菌，可采用小培養法，快速簡便易于觀察。而對于雙相型真菌還須經過腦心浸液培養基轉相試驗后確證。而血清學及分子生物學則主要用于流行病學和一些難培養難鑒定真菌的檢驗，由于成本高或要求技術難度較高，故而不適合在常規工作中采

　　真菌的培養特性

　　真菌的營養要求不向。在一般細菌培養基上均能生長。檢查時常用沙保培養基。此培養基成分簡單，主要含有1%蛋白陳、4%葡萄糖和2%瓊脂，pH佰55.皮膚癬拘在此培養基上生長較慢，常需1～4周;世腐生性真構在此培養基上生長迅速。故分離真菌時常在此培養基戶加一定量的放線菌酮和氯霉素，前者用于抑制污染真菌，后者用于抑制細慚的生長。有些病原性真菌，如白假絲酵球菌、組織腦漿茵、新生隱球菌竿加放線菌酮即不能生良，故宜用力抗生京的血瓊脂平板，見有生長后移種沙保培養基，并問時做玻片培養以觀察其自然狀態下的形態結構。 培養真菌最適宜的酸堿度是PH值4.0～6.0，淺部感染真菌的最道溫度為22～28℃，但某些誅部感染真菌一般在37℃牛長最好。培養真菌需較尚的濕度與氧。

　　真菌的培養方法

　　玻片培養又稱小培養，小培養法可以隨時觀察真菌的生長形態(如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等)，還可以隨時觀察其生長發育的全部情況，有利于菌種的鑒定。

　　1、鋼環法

　　(1)材料：白假絲酵母菌、沙保弱培養基、無菌玻片、蓋玻片、鋼環(帶有缺 口)、石蠟。

　　(2)方法

　　①用無菌鑷子取無菌小培養鋼環，環的兩面分別蘸取熔化的固體石蠟，平置于無菌載玻片上，另取一無菌蓋玻片，在酒精燈火焰上加熱后覆蓋于鋼環上，待冷后，小培養鋼圈即被固定于載玻片與蓋玻片之間。

　　②用毛細滴管吸取融化的培養基，從鋼環上端孔注入，注入量占容積的1/2即可。

　　③培養基冷卻凝固后，用接種針挑取材料，由上端孔接種于環內培養基上。

　　④置濕盒內，室溫或37℃下培養2—3d后，逐日觀察，鏡下可連續看到真菌生長過程及菌絲、孢子等特征，一般7d左右即可長好。

　　⑤也可不用小培養鋼環，直接將融化的培養基滴于無菌玻片上，待冷凝后從周邊接種材料，用蓋玻片覆蓋后培養，在顯微鏡下連續觀察生長情況。

　　(3)結果：鏡下觀察可見到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌絲。

　　2、小塊瓊脂玻片培養法

　　用無菌操作法將制好的待用瓊脂平板用無菌接種針或接種環切成大約1cm2的方塊，將其放置于滅菌的載玻片上。將標本或待檢菌接種于瓊脂塊四周邊緣靠上方部位，然后用無菌鑷子取一無菌的蓋玻片蓋在瓊脂上。在無菌平皿內放入少量無菌水和一個無菌U形(或V形)玻璃棒。將此載玻片置于玻璃棒上，蓋上平皿蓋培養。每日用肉眼和顯微鏡觀察孢子和菌絲的特點。

　　拓展內容

　　生物學真菌的形態特征

　　與細菌相比，真菌的大小、形態、結構和化學組成均有很大的差異。真菌比細菌大幾倍至幾十倍，可以用普通光學顯微鏡觀察。真菌的細胞是典型的真核細胞，真菌細胞具有細胞壁、細胞膜、細胞核、細胞器及細胞質。真菌細胞壁主要化學成分為幾丁質(chitin)和1，3-葡聚糖，而細菌細胞壁主要化學成分為肽聚糖。真菌按形態可分為單細胞和多細胞兩類。單細胞真菌主要為酵母菌(yeast)和酵母樣菌(veast-1ike)，菌體呈圓形或卵圓形，其形成的菌落為酵母型或類酵母型，臨床常見的有念珠菌屬和新生隱球菌。多細胞真菌由菌絲和孢子組成，菌絲伸長分支，交織成團形成菌絲體(mycelium)，并長有各種孢子，這類真菌稱為絲狀菌(filamentousfungus)，俗稱霉菌(mold)。其形成的菌落為絲狀型。對人致病的有皮膚癬菌等。有些真菌可因營養、溫度、氧氣等環境條件的改變，而兩種形態發生互變，稱為二相性(dimorphic)。真菌的菌落形態、顏色變化及真菌不同生長時期的鏡下特征是正確鑒定真菌的重要依據。

　　(一)真囂的鏡下形態

　　多細胞真菌的菌絲和孢子隨真菌種類不同而形態不同，是鑒別真菌的重要依據。

　　1.菌絲是由孢子出芽形成的。孢子在環境適宜的條件下長出芽管，逐漸延長呈絲狀即菌絲(hyphae)。當菌絲不斷生長、分支并交織成團時，被稱為菌絲體(mycelium)。孽警粵結構不同可分為有隔菌絲和無隔菌絲。有隔菌絲(septatehyphae)是由橫隔將管狀尊構的菌絲分隔成一連串多樣的絲狀體，如曲霉、青霉和毛癬菌等大多數絲狀真菌的菌絲屬于此類：無隔菌絲

　　無隔膜，整條菌絲為單個細胞，細胞質內有多個細胞核，根霉和毛霉的菌絲屬于此類。菌絲在人工培養基中生長，按其著生情況可分為營喬麗絲(vegetativehyphae)和氣生菌絲(aerialhyphae)。菌絲向下生長，深入培養基內獲取營養的菌絲稱為營養菌絲：而從培養基表面長出向空中伸展的菌絲稱為氣生菌絲。部分氣生菌絲發育到一定階段可衍化為具有繁殖能力的繁殖菌絲(reproductivehyphae)。菌縫可有多種形態，如螺旋狀、球拍狀、結節狀、鹿角狀、梳狀和關節狀等，它們有助于真菌的鑒別。

　　2.孢子是的繁殖結構，分為有性孢子和無性孢子兩類。有性孢子是由同一里體璧不同菌體上的兩個細胞融臺經減數分裂形成。無性孢子由菌絲上的細菌直接分化或出芽形成，是病原性真菌傳播和延續后代的主要方式。真菌孢子抵抗力不強，加熱60～70℃短時間即死亡。真菌孢子與細菌芽胞不同，其區別見表22-1。

　　(1)無性孢子：無性孢子根據形態分為分生孢子、葉狀孢子和孢子囊孢子三種。

　　①分生孢子：分生孢子是真菌中最常見的一種無性孢子。它首先在繁殖菌絲的末端分化形成分生孢子梗，然后在梗上產生分生孢子。按其形態和結構可分為大分生孢子和小分生孢子。大分生孢子(macroconidium)體積較大，分隔成較多細胞，常呈梭形、棍棒型或梨形。其大小、細胞數和顏色是鑒定真菌的重要依據。小分生孢子體積較小，單細胞性，外壁薄，有球形、卵形、梨形以及棍棒狀等各種不同形態。真菌都能產生小分生孢子，其診斷意義不大。

　　②葉狀孢子(thallospore)：葉狀孢子是由菌絲細胞轉變為分生孢子，有芽生孢子、關節孢子和厚膜孢子三種。芽生孢子(blastospore)由菌細胞直接出芽而形成，如酵母菌。芽生孢子長到一定大小一般會與母體脫離，若不與母體脫離，便延長呈絲狀，形成假菌絲，多數念珠菌屬菌種可形成假菌絲。關節孢子

　　(arthroconidium)是由菌絲生長到一定階段后，出現很多橫隔膜，然后從橫膈膜處斷裂形成矩形、筒形或短柱狀的孢子。如毛孢子菌、球孢子菌等。厚膜孢子(chlamydospore)由菌絲內胞漿濃縮，壁增厚，為躲避不利環境而形成的休眠細胞。當條件適宜時又可出芽繁殖。如白色念珠菌、絮狀表皮癬菌等可產生。

　　③孢子囊孢子(sporangiospore)：孢子囊孢子由菌絲末端膨大形成囊狀結構即孢子囊。其內密集許多細胞核，每個核都被細胞質包圍，分隔割裂成塊，并逐漸形成孢子壁，最終成為孢子囊孢子。毛霉菌、根霉菌等絲狀真菌和酵母樣真菌可產生此類孢子。

　　(2)有性孢子：有性孢子分為卵孢子、接合孢子、子囊孢子和擔孢子。多見于非致病性

　　(二)真菌的菌落特征

　　多數真菌的培養條件要求不高，在培養基上形成的菌落形態主要有以下兩種。

　　1．酵母型菌落形態與一般細菌菌落相似，但較大些，表面光滑、濕潤、柔軟、邊緣整齊、奶酪樣。菌細胞以單細胞芽生方式繁殖，不形成真、假菌絲。新生隱球菌的菌落屬于此型。有些單細胞性真菌孢子出芽形成芽管，芽管延長不

　　與母細胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向培養基深部生長，這種菌落稱為類酵母型(或酵母樣)菌落，如念珠菌屬的多數菌種。

　　2．絲狀型菌落是多細胞真菌的菌落形式，由許多管狀、分支的菌絲體和分生孢子組成。菌落呈羊毛狀、鵝毛狀、棉絮狀、絨毛狀和粉末狀，正、反面呈不同的顏色。曲霉、青霉、毛霉和皮膚癬菌等的菌落屬于此型。絲狀型菌落的形態、結構和顏色常作為鑒別真菌的依據。

　　二相性真菌在35~37℃條件下培養，在體內或在含動物蛋白的培養基上可形成酵母型菌落；在22～28℃條件下培養，在普通培養基上可形成絲狀型菌落，如馬爾尼菲青霉菌、粗球孢子菌、副球孢子菌和申克孢子絲菌等。

【真菌培養及鑒定方法有哪些】相關文章：

真菌檢測鑒定方法有哪些10-26

寶寶能力培養方法有哪些04-19

培養孩子好習慣的方法有哪些03-08

培養孩子誠實守信的品德的方法有哪些10-19

父母培養寶寶感知力的方法有哪些08-29

培養幼兒寶寶好性格須知的要點與方法有哪些09-06

鑒定瑪瑙真假有哪些好的方法02-15

培養寶寶的抓握技巧和認知能力的方法有哪些10-11

培養幼兒語言表達能力的方法有哪些10-18