腸道微生物研究中T-RFLP分析技術的運用論文
摘要：限制性末端片段長度多態性分析技術（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP）具有高通量，低成本，低勞動力等特點，是微生物生態學家在探索群落結構，功能及其動態變化中的一項實用方便的工具。自2012年至今，T-RFLP在腸道微生物領域研究方向不斷拓寬，隨后T-RFLP技術被更多的應用于人體相關疾病與腸道微生物關系的研究中。盡管T-RFLP技術仍存在不足，但隨著16Sr RNA基因序列數據庫和引物的改進，數據生成和分析統計工具的運用，T-RFLP最終將能在各個領域體現其價值，為人類疾病研究事業帶來貢獻。
關鍵詞：限制性末端片段長度多態性分析；腸道菌群；動態變化；多樣性
1 T-RFLP 技術簡介
1.1 T-RFLP 技術原理
T-RFLP分析技術是一種利用對細菌基因組中的保守序列（如16Sr DNA）的T-RFs長度的多態性分析進而實現對細菌分型的群落研究技術。該技術的基本原理是根據靶序列的保守區設計通用引物，以熒光標記引物的5‘末端，并用限制性內切酶對目標片段進行酶切，隨后以待分析樣的總DNA為模板進行PCR擴增，再選用合適的限制性內切酶消化擴增產物。由于核苷酸序列在不同菌的擴增片段中存在差異，酶切位點也不盡相同，據此得到不同長度的限制性片段。最后對消化后的產物進行自動測序儀測定，只有末端帶有熒光性標記的片段能被檢測并可用T-RFs反映了微生物群落的組成情況。因此可用全部帶有熒光的T-RFs的長度和豐度代表群落結構的多樣性。
1.2 T-RFLP 分析腸道微生物的主要步驟
T-RFLP分析腸道微生物的主要步驟包括：（1）DNA的提取；（2）標記引物分子PCR擴增；（3）擴增產物的純化、酶切；（4）結果測定及分析。
1.3 T-RFLP 技術評價
隨著T-RFLP的廣泛運用，T-RFLP技術在關鍵環節上的不足也被暴露出來，本部分主要將T-RFLP技術與另一指紋圖譜技術DGGE的優缺點進行比較（表1）。
2 技術在腸道微生物研究方面的應用
2.1 T-RFLP 的實驗對象的發展
嚙齒類動物、哺乳動物、環節動物、魚類、禽類和人類等均可作為T-RFLP檢測的實驗對象。T-RFLP早年的實驗對象多為魚類、禽類、嚙齒類動物、哺乳類動物等，自2012年至今，T-RFLP研究領域不斷拓寬，從大鼠，小鼠等實驗動物階段到廣泛應用于養殖業以及野生動物保護研究。隨后， T-RFLP技術被大量運用于與人體相關的飲食因素，疾病研究當中。Akira Andoh等[4]通過將患者與健康受試者腸道的微生物組成進行組間及組內對比后發現患者與受試者，發現病人腸道內含有健康個體沒有的胃瘤球菌屬、真細菌、梭菌、γ-變形菌、非典型的擬桿菌和非典型乳桿菌，得出克萊恩病（Crohn'sdisease）與腸道菌群的`組成有關系。Katsuyuki Fukuda等[5]通過對患不同類型化膿性大腸炎病人的腸道微生物進行T-RFLP分析，再對其結果進行線性判別分析并計算出判別系數后發現，判別系數與化膿性大腸炎的活動性程度有關，提示可以通過判別系數DS對化膿性大腸炎的活動性進行預測與判斷。
2.2 T-RFLP 具體方法的應用發展
T-RFLP的方法分為單熒光T-RFLP和雙熒光T-RFLP,張慧等[6]建立的雙熒光T-RFLP在準確性和靈敏性方面，與傳統T-RFLP技術相比基本一致或優于。通過參數優化，可以在保證準確度的前提下，獲得較高的靈敏度。由于單熒光T-RFLP成本低廉，檢測結果的準確性和靈敏度可以滿足大多數實驗要求，近些年，大部分研究使用的均為單熒光T-RFLP.
T-RFLP檢測過程涉及引物、酶、熒光素等。常見的真菌引物為ITS1F、ITS4R,古生菌引物為Ar3f、Ar927r,常用的細菌引物為27F、8F、63F、7F、1492R、1510R等，熒光一般標記27F、8F、63F引物的5’端，其中27F和8F最為常用。目前常用的熒光物質有6-羧基熒光素、NED、Cy5、D4熒光素等。T-RFLP技術一般用引物擴增細菌片段16Sr RNA和16Sr DNA,真菌的擴增片段是ITS序列，古生菌為16Sr RNA.用于酶切PCR擴增產物的限制性內切酶較多，其中Msp I、Hha I、Hae III、Rsa I比較常用；隨著T-RFLP技術的發展，限制性內切酶種類也越來越多，近兩年相繼出現了實驗使用限制性內切酶Bfa I和Alu I.
2.3 腸道菌群數據分析方法進展
可用于T-RFLP數據分析的方法較多。原始T-RFLP數據可以利用TAP-T-RFLP和T-RFPred等在線工具，用一些抑制酶和其相關的“T-RFs”模式的預測對16Sr RNA基因（庫）進行電子消化后分析。最近，一些應用如系統賦值工具（PAT），T-對齊（T-Align），ARB集成軟件工具，TRF-CUT,TRi FLe和T-RFLP統計數據分析軟件[7]等被運用的較多，其可用于完成剖面對比、樹狀圖形式等任務從而對數據和相似性的表達進行統計分析。在眾多分析方法中，一般而言，PCA,MDS,SOM和AMMI推薦用于群落成員之間相似性和差異性的可視化處理；集群分析和貝葉斯分析用于分群鑒定；CCA和RDA用于將微生物群落變化與環境的變化聯系起來[8].
3 技術前景展望
T-RFLP技術盡管還存在不足，但毋庸置疑，其仍然是現今最好的分析微生物群落結構的工具之一。將來，隨著16Sr RNA基因序列數據庫和引物的改進，數據生成和分析過程中精制協議和統計工具的運用以及分析方法的分辨率和分析技術的不斷提高，T-RFLP最終將能在腸道微生物群落結構，微生物與環境、宿主之間的關系等方面將發揮更大的作用。隨著時間的推移，我們有理由相信T-RFLP技術將會越來越成熟，也將在人腸道菌群與人類健康的研究領域中發揮重要的作用。
參考文獻：
[1]Osborn AM, Moore ERB, Timmis KN （1999） An evaluation ofterminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）analysis for the study of microbial community dynamics. EnvironMicrobiol,2000（1）：39-50.
[2]孫慶華，柏耀輝，趙翠 等。DGGE、T-RFLP、LH-PCR 對兩種活性污泥的微生物種群多樣性分析的比較[J].環境工程學報，2009（8）：1365-1369.
[3]Osborn AM, Moore ERB, Timmis KN （1999） An evaluation ofterminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）analysis for the study of microbial community dynamics. EnvironMicrobiol,2000（1）：39-50.
[4]Akira Andoh,Toshio Kobayashi et al.;Characterization of gutmicrobiota profiles by disease activity in patients with Crohn'sdisease using data mining analysis of terminal restrictionfragment length polymorphisms;Biomedical Reports 2014（2）：370-373.
[5]Katsuyuki Fukuda,Yoshiyuki Fujita;Determination of the dis-criminant score of intestinal microbiota as a biomarker ofdisease activity in patients with ulcerative colitis;BMC Gas-troenterology 2014（14）：49.
[6]張惠。雙熒光 T-RFLP 方法的建立及應用[D].大連海事大學，2012.
[7]Ricke P, Kolb S, Braker G Application of newly developed ARBsoftware- integrated tool for in silico terminal restrictionfragment length polymorphism analysis reveals the dominanceof a novel pmo A cluster in forest soil. Appl Environ Microbiol,2005（71）：1671-1673.
[8]Hugenholtz P, Goebel BM, Pace NR Impact of culture indepen-dent studies on the emerging phylogenetic view of bacterialdiversity. J Bacteriol,1998（180）：4765-4774.
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