影響免疫檢測的因素有哪些

　　影響免疫檢測的因素有很多，包括緩沖液、封閉、抗體、清洗、檢測底物等等。下面是yjbys小編為大家帶來的影響免疫檢測的因素的知識，歡迎閱讀。

　　緩沖液

　　最常用的兩種緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液(TBS)。調整配方中緩沖液組分的各種改良配方已見諸期刊。緩沖液的關鍵要求是它應有助于保持抗體的生物活性。因此，離子強度和pH值應相當接近生理狀態。PBS的配方(磷酸鹽總濃度10mM)適用于廣泛的抗體和檢測底物。

　　在孵育過程中，裝有膜的容器應輕輕搖動。緩沖液的量應足夠，完全覆蓋膜，使其在緩沖液中自由漂浮。如果不止一張印跡放在容器中，緩沖液容量不足會導致印跡膜粘在一起。這將影響孵育溶液的充分接觸，導致各種假象，如背景高、信號弱和靈敏度不均勻等。

　　封閉

　　要獲得有意義的結果，必須保證抗體只與感興趣的蛋白質結合，而不與膜結合。利用惰性蛋白、非離子去污劑，或無蛋白的封閉劑來封閉膜上未被占據的位點，可減少抗體的非特異結合(NSB)。

　　封閉劑與膜的親和力應高于抗體。它應填滿膜上未被占據的位點，但不會替換膜上的目標蛋白。最常用的封閉劑是牛血清白蛋白(BSA，0.2-5.0%)、脫脂牛奶、酪蛋白、明膠、吐溫20去污劑的稀釋液(0.05-0.1%)以及Bløk®試劑。封閉劑通常溶解在PBS或TBS中。

　　與封閉相關的風險包括：選擇不適當的封閉劑或過量封閉會替換或掩蓋目標蛋白質。因此，封閉劑的正確選擇對成功的免疫檢測很關鍵。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白標記的抗體，因為牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特異性抗體對磷酸化蛋白進行檢測分析時，如果采用粗蛋白制劑作為封閉劑，由于這些制劑中可能含有磷酸酶，而印跡上的磷酸化蛋白會被這些酶去磷酸化，就有可能會影響分析結果。研究表明，在封閉液中添加磷酸酶抑制劑可增強磷酸化特異性抗體的信號。此外，適用于一種抗原-抗體組合的封閉劑可能不適用于其他組合。

　　封閉液被點樣在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸潤，并在TBS中平衡。隨后在印跡上添加檢測試劑，孵育5分鐘，并曝光在X射線膠片上。暗斑的出現則表明封閉劑與檢測試劑不兼容。如果在標準的Western印跡操作中用Immobilon®-P轉印膜來替代Immobilon®-PSQ轉印膜，那么封閉液可能不足以飽和膜表面。可能需要更多的清洗步驟來降低背景。

　　抗體

　　在封閉之后，印跡與一個或多個抗體孵育。第一個抗體與目標蛋白結合，而第二個抗體與第一個結合。第二個抗體結合有酶或染料，可用來指示蛋白的位置。

　　盡管一抗能直接標記，但使用二抗有明顯的優勢。首先，不止一個二抗分子能夠與單個一抗分子結合，形成信號擴增。其次，標記的二抗(酶-抗體結合物)可用于大量不同特異性的一抗，從而不再需要標記多個一抗。

　　多克隆或單克隆的一抗都可使用。多克隆抗體通常是以抗血清或親和純化的抗體形式提供的。單克隆抗體是在腹水或組織培養液中表達的，可直接使用或進行親和純化。一定要記住，變性蛋白可能無法被天然抗原培育出的抗體所識別。在某些情況下，可能需要非變性凝膠來進行印跡。抗體以緩沖液和封閉液稀釋，以避免與膜的非特異結合。抗體稀釋液通常也包含痕量的吐溫20或另一種去污劑，以防止抗體的非特異聚集。許多發表的化學發光操作需要在封閉液和抗體稀釋液中添加0.1%(v/v)吐溫20。我們必須認識到，高于0.05%(v/v)的濃度有可能從膜上洗掉一些印跡的蛋白質。

　　提高吐溫20去污劑的濃度通常會降低背景。一種更簡單且更經濟的策略是降低抗體的濃度，特別是二抗(詳見圖1)。抗體必須特異針對目的蛋白，不能與封閉液中的組分交叉反應，且應該是相對純凈的。其他蛋白質或聚集物形式的雜質會導致非特異性結合和背景增高。

　　免疫檢測是一種極其靈敏的方法。為了實現高的信噪比和最高的靈敏度，一抗和二抗的濃度應針對每種情況來優化。一般來說，高倍稀釋一抗或降低凝膠上的蛋白上樣量可減少非特異信號。高倍稀釋酶標記的二抗可最大限度降低整體的高背景。

　　一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測試劑的靈敏度。高靈敏度的試劑(檢測到飛克級)與低靈敏度的試劑(檢測到皮克級)相比，抗體用量可減少20倍。抗體濃度的優化取決于檢測底物的例子如圖13所示。在使用最靈敏的檢測試劑時，過量的抗體導致高的非特異性和整體背景增高(左上)。在這種情況下，將一抗稀釋度從1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用沒那么靈敏的檢測試劑(中間和最下面一行)時，抗體需要更為濃縮，以產生相同的信號。

　　清洗

　　清洗印跡，從膜上去除未結合的抗體，它們可能導致高背景和檢測不佳。通常使用吐溫20的PBS或TBS稀釋液(0.05% v/v)，特別是當抗體制劑是粗制的，或高濃度使用時。如前所述，濃縮的去污劑溶液可能導致感興趣的蛋白質從膜上洗脫。對于高度純化的抗體，往往只使用緩沖液進行清洗。

　　所需的清洗次數最好根據實驗來確定。清洗太少會產生過多的背景，而清洗過度有可能洗脫抗體并降低信號。建議至少清洗三次，每次5分鐘。

　　在TBS清洗液中添加最多0.5M NaCl和0.2% SDS，并將清洗時間延長至2小時，可降低頑固的背景。

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