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《微生物的實驗室培養(yǎng)》教案分析

　　培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

《微生物的實驗室培養(yǎng)》教案分析

　　培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑）后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)，固體培養(yǎng)基應(yīng)用于微生物的分離和鑒定，半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運(yùn)動及菌種保藏等。

　　按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成，常用于實際工業(yè)生產(chǎn)。

　　按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長，促進(jìn)所需要的微生物的生長。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。

　　培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括水、無機(jī)鹽、碳源、氮源（生長因子）等。

　　碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無機(jī)碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機(jī)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

　　氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3-、NH4+（無機(jī)氮源）蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有機(jī)氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

　　培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件

　　無菌技術(shù)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：

　　①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。

　　②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。

　　③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。

　　④實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

　　無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？

　　答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。

　　消毒與滅菌的區(qū)別

　　消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（對于一些不耐高溫的液體）還有化學(xué)藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。

　　滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。

　　滅菌方法：

　　①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；

　　②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；

　　③培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。

　　④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

　　倒平板操作的討論

　　1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？

　　提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。

　　2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

　　答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

　　3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

　　答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以防止培養(yǎng)基表面的水分過度地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

　　4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

　　答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。

　　純化大腸桿菌

　　（1）微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

　　（2）平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體，這就是菌落。

　　（3）稀釋涂布平板法是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

　　（4）用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。

　　（5）平板劃線法操作步驟：

　　①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。

　　③將試管口通過火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。

　　⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　平板劃線操作的討論

　　1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

　　答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

　　2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

　　答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

　　3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

　　答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。

　　（6）涂布平板操作的步驟：

　　①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。

　　③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s。

　　④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。

　　涂布平板操作的討論

　　涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

　　提示：應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。

　　菌種的保存