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細菌分離鑒定
目的要求：
熟悉臨床標本中常見的病原性細菌的分離鑒定方法。
實驗內(nèi)容：
一、膿汁、咽拭子等標本中病原性細菌的分離與鑒定
(一)標本采集
1.膿拭子：用無菌棉簽蘸取患處深部膿液或分泌物少許，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。
2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用無菌棉簽挑取膿稠痰塊，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。
3.咽拭子：囑病人把口張大，用壓舌板壓住舌根，用無菌棉簽迅速蘸取咽部分泌物，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。
4.血標本：疑為敗血癥患者，在嚴格無菌操作下，靜脈采血，床旁直接加入含50ml的肉湯瓶內(nèi)，立即搖勻后送培養(yǎng)。
5.腦脊液：對疑似流腦患者，作腰椎穿刺取腦脊液，立即行直接床旁接種(送檢過程中應(yīng)注意保溫)。
6.尿道、陰-道分泌物：對可疑淋病患者，男性可從尿道取材，取材時導(dǎo)尿管應(yīng)進入尿道1cm～2cm，如為剛排尿，應(yīng)等待1h左右;女性則可以從宮頸口取分泌物，當內(nèi)窺器插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)取出，取材應(yīng)立即送檢，不可放置冰箱。
(二)分離鑒定程序
待檢標本可直接做涂片染色檢查鑒定，必要時可做分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)及致病性鑒定。常見的致病性球菌檢查程序如下。
直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài)、排列、染色性)
膿、痰、咽拭子
分泌物、腦脊液 觀察菌落性狀、溶血性、色素
血瓊脂平板→ 涂片、染色、鏡檢
↑ 挑取可疑菌落 生化反應(yīng)
血液、穿刺液 →肉湯培養(yǎng)基 純分離 致病性測定
↓ 藥敏試驗
如培養(yǎng)液混濁時可涂片、染色、鏡檢
(三)常見臨床標本的檢查方法
1．膿拭子
在膿汁中除了球菌外，也有桿菌存在，例如革蘭陽性的有炭疽桿菌、白喉桿菌、結(jié)核桿菌、枯草桿菌等，革蘭陰性的有大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，此外尚可有真菌、放線菌、螺旋體等。
材料
(1) 標本：膿拭子
(2) 培養(yǎng)基：血瓊脂平板
(3) 兔血漿、白色濾紙片、無菌生理鹽水、載玻片
方法 膿汁 → 革蘭染色 → 鏡檢
↓ ↑
血瓊脂平板 →觀察菌落形態(tài)及溶血情況
↓
致病力試驗
(1)將膿拭子作革蘭染色，鏡檢(先作培養(yǎng)再涂片以免污染)。標本放置4℃冰箱保存，待報告發(fā)出后再丟棄。
(2)將膿汁涂布于血瓊脂平板上，再以滅菌接種環(huán)作劃線分離。置培養(yǎng)37℃培養(yǎng)18h～24h。
(3)經(jīng)培養(yǎng)后據(jù)菌落特點及涂片檢查結(jié)果進行初步識別，根據(jù)需要再作進一步鑒定。若菌落較大、溶血透明、產(chǎn)生金黃色色素、涂片為革蘭陽性球菌并成堆排列時可能系葡萄球菌，應(yīng)確定其為何種葡萄球菌;必要時再作血漿凝固酶試驗及甘露醇發(fā)酵試驗，確定其致病力。
2.咽拭子
咽喉中存在的細菌較多，可以有厭氧及需氧性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四聯(lián)球菌、腦膜炎球菌、卡他球菌、喉桿菌、結(jié)核桿菌枯草桿菌、百日咳桿菌肺炎桿菌及綠膿桿菌等。此外也可有白色念珠菌奮森螺旋體等。本實驗以咽拭子作為標本，重點檢查病原性球菌。
材料
(1)標本:咽拭子。
(2)培養(yǎng)基:血瓊脂平板。
方法
咽拭子
↓
血瓊脂平板
↓
觀察菌落形態(tài)及溶血性
↓
革蘭染色，鏡檢
取標本涂布于血瓊脂平板，再以滅菌接種環(huán)劃線分離，置37℃培養(yǎng)18h～24h培養(yǎng)。標本放置4℃冰箱保存，待報告發(fā)出后再丟棄。
可根據(jù)下述特點進行鑒別：
(1)在菌落周圍產(chǎn)生2mm～4mm寬、界線分明、完全透明的溶血環(huán)、涂片為革蘭陽性球菌并呈鏈狀排列，可能是乙型溶血性鏈球菌。
(2)菌落細孝半透明、有草綠色溶血環(huán)、涂片為革蘭陽性球菌呈鏈狀排列，可能為甲型溶血性鏈球菌。需要進一步與肺炎球菌區(qū)別時，可做膽汁溶菌試驗及菊糖發(fā)酵反應(yīng)。
菌落細小半透明、不溶血、涂片為革蘭陽性鏈狀排列的球菌時，為丙型鏈球菌。
(4)菌落扁平邊緣隆起、中央稍凹、半透明、呈草綠色溶血、革蘭染色為陽性雙球菌、呈矛頭狀排列時為肺炎球菌，應(yīng)以膽汁溶菌及菊糖發(fā)酵反應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌區(qū)分。
(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革蘭染色為陰性雙球菌，呈腎形排列時，可能為腦膜炎球菌，需要進一步作氧化酶試驗及糖發(fā)酵試驗(接種于含血清之葡、麥、蔗糖發(fā)酵管中)。
二、糞便標本中腸道桿菌的分離與鑒定
(一)標本收集
取患者的糞便或肛-門拭子。
(二)鑒定程序
腸道桿菌為一大群革蘭陰性桿菌，從形態(tài)及染色性上無法鑒別為何種菌，只能依靠生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)進行鑒定。
患者糞便(粘液、膿血)→腸道選擇、鑒別培養(yǎng)基(如ss、中國藍、伊紅美蘭)
↓
挑取可疑菌落(據(jù)大孝顏色、透明度而定)
↓
雙糖鐵及其他鑒別培養(yǎng)基
↓
據(jù)結(jié)果分析鑒定
↓
玻片凝集(做出特異性診斷)
葡萄糖乳糖動力H2S尿素
⊕⊕±--艾希菌屬非致病菌
⊕+---克雷伯菌屬
⊕±+++變形桿菌
⊕-++-乙型副傷寒致病菌
⊕-+±-甲型副傷寒
+-++-傷寒桿菌
+----痢疾桿菌
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