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真菌的分子鑒定
內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一段時期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌。近年來的研究表明，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物，對相應(yīng)的內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究已經(jīng)成為尋找藥物來源的一種新途經(jīng)。 本文以我國特有藥用植物——喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)為實(shí)驗(yàn)材料，對喜樹內(nèi)生真菌的組織分布及分離方法進(jìn)行初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生真菌分離的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞結(jié)合的方法較好。對喜樹的根部和莖部的升汞消毒時間以4～5min為宜，喜樹葉子的升汞消毒時間應(yīng)控制在2min左右。在所試條件下共計(jì)分離得到70株內(nèi)生真菌，主要分布在樹葉(42.9%)和皮部(35.7%)，根部(14.3%)和種子(7.1%)中的內(nèi)生真菌數(shù)目較少，在木質(zhì)部未分離到內(nèi)生真菌。 采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法對所得菌株進(jìn)行鑒定。應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法共鑒定出6株內(nèi)生真菌，分布于6屬。按照培養(yǎng)特征，把所得內(nèi)生真菌歸為27個形態(tài)類群。選取不同形態(tài)類群中的代表菌株，擴(kuò)增并測定其rDNAITS區(qū)段的DNA序列，結(jié)合內(nèi)生真菌與GenBank中參考菌株堿基序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，確定其分類地位。共獲得18株內(nèi)生真菌的ITS序列，分析結(jié)果表明，這18株內(nèi)生真菌分屬于2個亞門，4綱，8目，8科，14屬;形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致。鑒定結(jié)果在一定程度上反應(yīng)了喜樹生態(tài)系內(nèi)生真菌的生物多樣性。在本研究中，共分離得到18株擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)菌株，占25.7%，為優(yōu)勢菌群，對其進(jìn)行了基于ITS區(qū)段的系統(tǒng)發(fā)育分析。 本文采用薄層層析TLC方法與高效液相色譜HPLC法，從3株內(nèi)生真菌CZ-14、CZ-17、CZ-18的發(fā)酵產(chǎn)物中檢出喜樹堿，含量為0.03-0.04mg/g。發(fā)酵產(chǎn)物是以喜樹種子煎汁液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一段時期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌。近年來的研究表明，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物，對相應(yīng)的內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究已經(jīng)成為尋找藥物來源的一種新途經(jīng)。 本文以我國特有藥用植物——喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)為實(shí)驗(yàn)材料，對喜樹內(nèi)生真菌的組織分布及分離方法進(jìn)行初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生真菌分離的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞結(jié)合的方法較好。對喜樹的根部和莖部的升汞消毒時間以4～5min為宜，喜樹葉子的升汞消毒時間應(yīng)控制在2min左右。在所試條件下共計(jì)分離得到70株內(nèi)生真菌，主要分布在樹葉(42.9%)和皮部(35.7%)，根部(14.3%)和種子(7.1%)中的內(nèi)生真菌數(shù)目較少，在木質(zhì)部未分離到內(nèi)生真菌。 采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)合的方法對所得菌株進(jìn)行鑒定。應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法共鑒定出6株內(nèi)生真菌，分布于6屬。按照培養(yǎng)特征，把所得內(nèi)生真菌歸為27個形態(tài)類群。選取不同形態(tài)類群中的代表菌株，擴(kuò)增并測定其rDNAITS區(qū)段的DNA序列，結(jié)合內(nèi)生真菌與GenBank中參考菌株堿基序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，確定其分類地位。共獲得18株內(nèi)生真菌的ITS序列，分析結(jié)果表明，這18株內(nèi)生真菌分屬于2個亞門，4綱，8目，8科，14屬;形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果一致。鑒定結(jié)果在一定程度上反應(yīng)了喜樹生態(tài)系內(nèi)生真菌的生物多樣性。在本研究中，共分離得到18株擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)菌株，占25.7%，為優(yōu)勢菌群，對其進(jìn)行了基于ITS區(qū)段的系統(tǒng)發(fā)育分析。 本文采用薄層層析TLC方法與高效液相色譜HPLC法，從3株內(nèi)生真菌CZ-14、CZ-17、CZ-18的發(fā)酵產(chǎn)物中檢出喜樹堿，含量為0.03-0.04mg/g。發(fā)酵產(chǎn)物是以喜樹種子煎汁液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
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